考马斯亮蓝法测蛋白浓度,具体步骤有哪些,需要什么试剂?

考马斯亮蓝法测蛋白浓度,具体步骤有哪些,需要什么试剂?

该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性多肽的定量.如核糖核酸酶或溶菌酶.去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果.如TritonX-100、SDS、NP-40等.
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95％乙醇,加入100ml浓磷酸,然后,用蒸馏水补充至200ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定.
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准.如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白.通常在20ug—150ug／100ul之间绘制标准曲线.
3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS).
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去.
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5～30rain.染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度.注意,显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度.
注意：
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉.待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍
三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇,8.5%（W/V）H3PO4.
2、 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）.
2、移液管使用（）.
（三）、标准曲线制作：
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
1、
2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线.
1）、利用标准曲线查出回归方程.
2）、用公式计算回归方程.
3）、或用origin作图 ,测出回归线性方程.即A595nm=a×X( )+6
一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上.
4）、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧.
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内）,依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量.
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算.
（五）、注意事项：
1、 玻璃仪器要洗涤干净.
2、 取量要准确.
3、 玻璃仪器要干燥,避免温度变化.
4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照.