比较基因工程与PCR技术在设计和原理上的异同

比较基因工程与PCR技术在设计和原理上的异同

基因工程的概念
　　基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品.基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术.原理：基因重组
　　技术：（一）基因工程的基本工具
　　1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
　　（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的.
　　（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性.
　　（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端.
　　2.“分子缝合针”——DNA连接酶
　　(1)两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
　　①相同点：都缝合磷酸二酯键.
　　②区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,T4DNA连接酶来源于T4噬菌体[1],只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低.
　　(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键.DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键.
　　3.“分子运输车”——载体
　　（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存.②具有一至多个限制酶切点,供外源DNA片段插入.③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择.
　　（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.
　　（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒.
PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应.DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链.在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端,并以此为起始点,沿模板5´→3´方向延伸,合成一条新的DNA互补链.
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液.类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.
⑵PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应” ,这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情况下,平台期的到来是不可避免的.
⑶PCR扩增产物 ：可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3' 端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合.引物在与新链结合时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”.不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用.